Информация, доклады, сообщения

О разработке молекулярно-генетических методов идентификации и типирования штаммов возбудителей инфекционного ларинготрахеита

12.12.2012

Отделом биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий - Обухов И. Л., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы представлен отчет по теме «Разработка молекулярно-генетических методов идентификации и типирования производственных и полевых штаммов возбудителей инфекционного ларинготрахеита». В отчете сообщается, что в 1 – 4 кварталах 2012 года проводилось изучение особенностей генома вируса, подбор и синтез праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР), оптимизация условий ПЦР, определение чувствительности и специфичности метода идентификации вируса, секвенирование ПЦР фрагментов различных штаммов и разработка получения длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) метода дифференциации штаммов, а также тестирование производственных штаммов и полевых изолятов и формирование базы данных нуклеотидных последовательностей. 

Инфекционный ларинготрахеит (ИЛТ) - вирусная контагиозная инфекция дыхательных путей у кур, индеек, фазанов - вызывается вирусом ларинготрахеита, относящемуся к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae. Геном вируса состоит из двухцепочечной линейной ДНК размером 155 тысяч пар нуклеотидов (п.н.).
 
При инфекционном ларинготрахеите у птиц поражается конъюнктива глаз, гортань, трахея, изменения в желудочно-кишечном тракте отсутствуют. У павших птиц выявляют кровоизлияния в гортани, слизисто-геморрагические пробки в трахее. Острая форма болезни характеризуется угнетением дыхания, выделением слизи с кровью и высокой смертностью.
 
Для профилактики инфекционного ларинготрахеита используются эмбриональные (chicken embryo-origin, CEO) и культуральные (tissue culture-origin, TСO) аттенуированные вакцины.
 
Для идентификации вируса ИЛТ методом ПЦР и дифференциации изолятов по вирулентности выбрана высоко консервативная область гена тимидинкиназы (ТК), играющая ключевую роль в вирулентности герпесвирусов. Замена единичной аминокислоты может привести к потере ТК активности и уменьшению вирулентности. Известно, что вирулентные штаммы, по сравнению с невирулентными, содержат Met252 вместо Thr252. Также ТК ген вакцинных и слабовирулентных штаммов вируса ИЛТ не имеет сигнальной последовательности для полиаденилирования мРНК ААТAAA, в отличие от вирулентных. Установлено основное генетическое отличие в области ТК гена вакцинных штаммов Thorne и 216 от остальных вирулентных и вакцинных штаммов – область между 101 и 104 а.к. остатком Pro101Val102Ala103Val104, так как для других штаммов характерна последовательности 101Arg102Arg103Val. Для дифференциации сильновирулентных полевых изолятов от слабовирулентных и вакцинных штаммов можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР.
 
Так как область гена тимидинкиназы является достаточно консервативной, для типирования близкородственных вакцинных штаммов вируса выбрана более вариабельная область генома – ген белка ICP4 – сверхраннего альфа-белка, регулирующего процессы транскрипции на ранних стадиях инфекционного процесса. При анализе последовательностей гена ICP4 из базы данных NCBI выявлен ряд характерных нуклеотидных различий среди опубликованных последовательностей вакцинных штаммов. Таким образом, секвенирование данной области позволит дифференцировать штаммы, используемые в вакцинах, и обнаруживать препараты, содержащие незаявленные штаммы или смесь генетически неоднородных штаммов.
 
В результате проведенных исследований был разработан ПЦР-метод для идентификации вируса инфекционного ларинготрахеита. Метод универсален в отношении объекта исследования, имеет высокую чувствительность и специфичность. Также разработан метод ПЦР-ПДРФ анализа гена тимидинкиназы для дифференциации штаммов и изолятов по вирулентности и метод типирования производственных штаммов и полевых изолятов на основе секвенирования фрагментов генома в областях генов тимидинкиназы ТК и регуляторного белка ICP4.
 
Помимо этого были изучены генетические характеристики ряда вакцинных и производственных штаммов по трем фрагментам генома вируса. По результатам данной работы формируется база данных нуклеотидных последовательностей отечественных и зарубежных вакцинных штаммов и изолятов. 

Пресс-служба ФГБУ «ВГНКИ»