Информация, доклады, сообщения

О разработке методики скринингового определения остаточного содержания трифенилметановых красителей в продукции аквакультуры методом ИФА

17.12.2012

Отдел безопасности кормов и пищевых продуктов ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий – Комаров А.А., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы по теме «Разработка методики скринингового определения остаточного содержания трифенилметановых красителей в продукции аквакультуры методом иммуноферментного анализа (ИФА)» представил отчет о завершении 8-го этапа данных исследований.

Трифенилметановые красители - производные диарил- и триарилметанов. Отдельные представители данной группы, в частности малахитовый зеленый, применяются для освобождения наружных покровов рыб от иофтириусов, хилодонелл, триходин, костий, сапролегний, ахлий. Вследствие этого, продукция рыбоводческих хозяйств может содержать остаточные количества данных веществ и их метаболитов. Установлено, что все трифенилметановые красители оказывают мутагенное, канцерогенное и тератогенное действие на организм человека.

Малахитовый зеленый (тетраметил-4,4-диаминотрифенилметан) (МЗ) — синтетический диаминотрифенилметановый краситель, представляет собой высокотоксичное вещество, ранее широко используемое в сельском хозяйстве для лечения и профилактики ряда болезней рыб. Сегодня его использование является нелегальным, однако и сейчас он иногда используется в рыбоводстве. Основные продукты, которые могут быть загрязнены МЗ – рыба и икра. Употребление в пищу продуктов, содержащих МЗ, опасно для человека, поскольку это соединение обладает выраженным канцерогенным действием. Вследствие простоты и низкой стоимости производства в некоторых странах этот препарат продолжают использовать при выращивании аквакультуры. Рыба и рыбные продукты, импортируемые из стран Латинской Америки, Китая, Тайваня и Юго-Восточной Азии часто содержат остаточные количества этого препарата.

В настоящее время международное законодательство, а также законодательство ЕС и США требуют систематического контроля в продукции аквакультуры остаточного содержания трифенилметановых красителей и их метаболитов. Согласно нормативным документам FDA данные соединения не должны там содержаться. В ЕС установлен минимальный требуемый предел эффективности определения их остатков в продукции аквакультуры (MRPL) – 2 мкг/кг (Commission Decision 2004/25/EC). Следовательно, существует необходимость в разработке чувствительных методик определения данных соединений.

В последнее десятилетие иммуноферментный анализ (ИФА) часто применяют для определения содержания остатков ксенобиотиков в продукции животноводства. Этот метод достаточно чувствителен, специфичен и прост в исполнении. За рубежом разработаны и нашли практическое применение диагностические тест-системы ИФА для определения остаточных количеств суммарного содержания МЗ и его основного метаболита лейкомалахитового зеленого (ЛМЗ) в продукции животноводства. Подобные отечественные тест-системы ИФА в настоящее время не внедрены в ветеринарную практику.

Известно, что МЗ быстро восстанавливается в организме до ЛМЗ, который может обнаруживаться в мышцах и тканях в течение месяца. Вследствие этого продукция рыбоводческих хозяйств может содержать остаточные количества данных веществ и их метаболитов.

В настоящее время международное законодательство, а также законодательство ЕС и США требуют систематического контроля в продукции аквакультуры остаточного содержания трифениллметановых красителей и их метаболитов. Согласно нормативным документам FDA данные соединения не должны содержаться в продукции аквакультуры. В ЕС установлен минимальный требуемый предел эффективности (MRPL) для суммарного содержания МЗ и ЛМЗ – 2 мкг кг-1. Однако, в некоторых странах, например в Канаде, законодательно установлен максимально допустимый уровень малахитового зеленого и его метаболита в рыбе, равный 1 мкг кг-1.

Цель настоящих исследований - разработка скрининговой методики определения остаточного количества трифенилметановых красителей в аквакультуре. Для скрининга -  получить иммунореагнеты, оптимизировать условия постановки ИФА и отработать условия пробоподготовки.

На основании полученных результатов была выбрана оптимальная комбинация иммунореагентов: моноклональные антитела против КМЗ-БСА и твердофазный антиген –КЛМЗ-БСА (10:1). С помощью данных реагентов можно определять МЗ в модельной системе в диапазоне от 0,1 до 10 мкг л-1.

В результате исследований были синтезированы коньюгаты производных малахитового зеленого с белками различными методами, проведено тестирование моноклональных антител на активность и специфичность в ИФА, подобраны оптимальные условия постановки реакции с целью разработки чувствительной и специфичной тест-системы ИФА, а также оптимизированы способы окисления, экстракции и очистки трифенилметановых красителей и их метаболитов из продукции аквакультуры для определения методом ИФА. 

Пресс-служба ФГБУ «ВГНКИ»