Информация, доклады, сообщения

О разработке тест-системы для выявления ДНК Actinobacillus pleuropneumoniae

20.12.2012

Отделом биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий - Обухов И. Л., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы представлен отчет по теме «Разработка тест-системы для выявления ДНК Actinobacillus pleuropneumoniae». В отчете сообщается, что тест-система предназначена для выявления ДНК возбудителя плевропневмонии свиней (Actinobacillus pleuropneumoniae) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». 

Актинобациллезная плевропневмония – высококонтагиозная болезнь свиней, характеризующаяся гипертермией, септицемией, геморрагической некротизирующей пневмонией и серозно-фибринозным плевритом. Заболевание вызывают бактерии семейства Pasterellaceae, принадлежащие к виду Actinobacillus pleuropneumoniae. Источником возбудителя инфекции являются бактерионосители и больные животные, из миндалин которых возбудитель выделяется в течение 3-4 месяцев после выздоровления. Существует 3 формы плевропневмонии: сверхострая, острая и хроническая. В настоящее время известно 12 серологических вариантов A. pleuropneumoniae. Наиболее часто в хозяйствах встречаются сероварианты 1, 3, 5а и 9. Диагноз ставится на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов выделения возбудителя болезни.
 
При разработке тест-системы на первом этапе была проанализирована литература, характеризующая структуру генома и различия на нуклеотидном уровне серовариантов Actinobacillus pleuropneumoniae. Далее был проведен поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома A. pleuropneumoniae, опубликованных в базе данных GeneBank.
 
На втором этапе было проведено выравнивание отобранных нуклеотидных последовательностей c целью их последующего анализа на вариабельность и поиска консервативных участков необходимых для выбора праймеров. В качестве мишени для специфических праймеров и зондов был выбран ген omlA, кодирующий предшественник липопротеина внешней оболочки возбудителя.
 
На следующем этапе была изучена специфичность предложенных праймеров с помощью компьютерной программы BLASTA online. В результате этой работы была показана гомология выбранных олигонуклеотидов только с геном omlA A. pleuropneumoniae и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями каких-либо других вирусов, бактерий или эукариот. Т. о., предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.
 
В тест-систему также были введены праймеры и зонд для внутреннего неконкурентного контроля. Введение этих праймеров позволяет контролировать качество выполнения всех этапов ПЦР-исследования.
 
Далее был проведен ряд экспериментов по определению рабочих концентраций праймеров и зондов, обеспечивающих необходимую чувствительность анализа, оптимизированы условия проведения ПЦР и определены специфичность и чувствительность тест-системы. Специфичность праймеров тестировали с использованием образцов геномной ДНК свиньи и целого ряда микроорганизмов.
 
Оценена возможность использования разработанной системы для выявления возбудителя в разных видах биологического материала – суспензии органов, мазках со слизистой носоглотки и миндалин. Проведены сравнительные испытания тест-системы при выделении ДНК двумя разными наборами реагентов.
 
Определение аналитической чувствительности проводилось на панелях образцов патматериала (смесь разных внутренних органов) и смывов со слизистой, содержащих рекомбинантный контроль, полученный путем клонирования участка гена-мишени в фаг λ. В данном эксперименте чувствительность составила 1x103 коп/мл для всех видов биологического материала.
 
Проверку работы тест-системы проводили на биологическом материале, полученном из разных областей РФ. Всего было проанализировано 138 проб, в 20 из них, что составило 14,5% исследованных образцов, обнаружен возбудитель актинобациллярной плевропневмонии. Положительные результаты подтверждены секвенированием.
 

Пресс-служба ФГБУ «ВГНКИ»