Информация, доклады, сообщения

О разработке методических указаний по подтверждающему (арбитражному) определению трифенилметановых красителей в продукции аквакультуры

10.12.2012

Отдел безопасности кормов и пищевых продуктов ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий – Комаров А.А., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы по теме «Разработка методических указаний по подтверждающему (арбитражному) определению трифенилметановых красителей в продукции аквакультуры методом сверх-высокоэффективной жидкостной хроматографии и времяпролетной масс-спектрометрии высокого разрешения» представил отчет о завершении 1-го этапа данных исследований, в ходе которых было намечено оптимизировать условия хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования трифенилметановых красителей в продукции аквакультуры, разработать схему подготовки образцов для определения трифенилметановых красителей, проверить правильность разработанной методики в международных сравнительных испытаниях.
 
Трифенилметановые красители (малахитовый зеленый, кристаллический фиолетовый, бриллиантовый зеленый) обладающие антипаразитарным и антигрибковым действием популярны из-за легкой доступности (благодаря широкому использованию) и меньшей стоимости по сравнению с немногочисленными аналогами.
 
Краситель добавляется непосредственно в воду, откуда попадает в организм рыбы, где сначала быстро метаболизируется до карбинольной формы, которая, обладая липофильными свойствами, легко проходит сквозь клеточную мембрану. Затем, внутри клеток, карбинольная форма переходит в метаболит: лейкомалахитовый зеленый, также обладающий гидрофобными свойствами. Считают, что 90% поглощенного рыбой красителя сохраняется в богатых жиром мышечных тканях в виде производного от 3 до 40 дней.
 
Токсичность малахитового зеленого показана в ходе множества экспериментов, и сделаны выводы о несомненном его канцерогенном эффекте.
 
Было сделано предположение, что N-деметилированные метаболиты малахитового зеленого могут проходить метаболическую активацию, аналогичную наблюдаемой у канцерогенных ароматических аминов, в том числе окисление до метаболитов, реагирующих с ДНК непосредственно или после этерификации. Точный механизм образования ДНК-аддуктов до сих пор неизвестен.
 
В 1992 году в Канаде ему был присвоен II класс опасности для здоровья, было постулировано, что употребление его с рыбой в пищу представляет серьезную опасность для здоровья, в связи с тем, что он является токсичным, также было постулировано его влияние на образование опухолей печени. Запрещен к применению в пищевой промышленности он также в США, Англии и Китае. Однако данные вещества широко применяются при выращивании аквакультуры в некоторых странах Юго-Восточной Азии и Латинской Америки. Кроме того из за широкого применения в качестве промышленных красителей, трифенилметановые красители могут накапливаться в окружающей среде и загрязнять продукцию аквакультуры. В связи с их канцерогенным и генотоксическим действием, применение этих лекарственных средств запрещено в США, Канаде, ЕС и других странах (21 CRF 589.1000).
 
В РФ трифенилметановые красители не зарегистрированы в качестве лекарственного средства в ветеринарии, поэтому, согласно п. 1.5 «Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), утв. решением комиссии таможенного союза №299 от 28.05.10г. (в редакциях решений Комиссий Таможенного союза от 17.08.10 №341; от 18.11.2010 №456; от 02.03.2011 №571; от 07.04.2011 №622; от 18.10.2011 №829)»: «При изготовлении продовольственного сырья животного происхождения не допускается использование ветеринарных препаратов (кормовых добавок, стимуляторов роста животных, в том числе гормональных препаратов, ветеринарных лекарственных средств, в том числе антибиотиков)… не допущенных к использованию в соответствии с законодательством государств-членов Таможенного союза», любое их остаточное содержание в продукции животноводства не допускается.
 
Согласно законодательству ЕС, лаборатории должны использовать методики, позволяющие обнаруживать остаточное содержание трифенилметановых красителей в Предел обнаружения методики, используемой ФГБУ «ВГНКИ» составляет 1 мкг/кг.
 
Работа включала в себя следующие этапы: оптимизирование условий хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования трифенилметановых красителей, разработка схемы подготовки образцов для определения трифенилметановых красителей, проверка правильности разработанной методики в международных сравнительных испытаниях.
 
На этапе оптимизации хроматографической части сопряженной системы сотрудники столкнулись с рядом трудностей, вызванных схожестью в структуре, и как следствие сложностью подбора подвижных фаз. В качестве подвижных фаз, в подобных работах многие авторы используют воду в качестве фазы А и ацетонитрил в качестве фазы Б. Однако, данные фазы показали неудовлетворительный результат. В результате серий экспериментов были подобраны оптимальные фазы, которые позволили получить хорошую форму пика и обеспечить достаточно большие временные интервалы между группами аналитов, благодаря которым удалось применить различные настройки масс-спектрометрической части системы.
 
На этапе оптимизации масс-спектрометрической части также были вынуждены искать компромисс между различными настройками. Серии экспериментов показали, что, оставив общие значения, сильно проигрываем в чувствительности. Данного явления удалось избежать, применив для каждой группы аналитов свои настройки. Также было важно найти оптимальный калибрант для системы в целом. Таким калибрантом оказался раствор формиата натрия. Благодаря наличию большого числа различных кластеров, он помог полностью решить проблемы с калибровкой. В результате проведенных исследований были разработаны методические указания по подтверждающему (арбитражному) определению трифенилметановых красителей в продукции аквакультуры методом сверх-высокоэффективной жидкостной хроматографии и времяпролетной масс-спектрометрии высокого разрешения.

Пресс-служба ФГБУ «ВГНКИ»