Информация, доклады, сообщения

О разработке системы праймеров и зондов для выявления и дифференциации вируса болезни Марека 2 и 3 серотипов

03.12.2012

Отделом биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий - Обухов И. Л., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы представлен отчет по теме «Разработка системы праймеров и зондов для выявления и дифференциации вируса болезни Марека 2 и 3 серотипов». В отчете сообщается, что возбудителем болезни Марека является Herpesvirus galli-2, представитель семейства Herpesviridae. В настоящий момент данное семейство представлено 200 открытыми видами герпесвирусов. По современной классификации группу вируса болезни Марека (ВБМ) подразделяют на 3 серотипа. Серотип 1 включает все онкогенные вирусы и аттенуированные варианты. Штаммы этого серотипа вируса различаются по патогенности: от вирулентных до высоковирулентных. Вирусы второго и третьего серотипов для кур не патогенны и используются для изготовления вакцин. 

В настоящее время имеется ряд вакцин против БМ, в том числе 3 вида живых вакцин:
1- вакцины из онкогенных штаммов ВБМ серотипа 1 (аттенуированные шт. HRS-B16, Md-5);
2 - из естественно ослабленных неонкогенных штаммов серотипа 2 (SB-1, C-80);
3 - гетерологичных ВГИ серотипа 3 (FC-126 HVT), а поливалентные вакцины из двух или трех серотипов.
 
Также существуют поливалентые вакцины и инактивированные вакцины из клеток или клеточных мембран культур клеток, зараженных вирусом.
 
Считается, что наиболее высокие защитные свойства имеют поливалентные вакцины, включающие штаммы группы ВБМ-ГВИ серотипов 1, 2 и 3. Би- и трех- валентные вакцины, включающие вакцинные шт. ВБМ и ВГИ, оказались значительно эффективнее моно- вакцин. Имеются данные о синегризме между шт. FC-126 (серотип 3) и SB-1 (серотип 2), между HVT (серотип 3) и 301B/I (серотип 2).
 
В связи с тем, что стандартные методы идентификации серотипов ВБМ в вакцинных препаратах трудоемки, продолжительны по времени и требуют значительных экономических затрат, большое распространение получает диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), как более чувствительная и оперативная.
 
На первом этапе была проанализирована литература, характеризующая структуру генома и различия на нуклеотидном уровне серотипов вируса болезни Марека. Далее был проведен поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса, опубликованных в базе данных GeneBank.
 
На следующем этапе была изучена специфичность предложенных праймеров с помощью компьютерной программы BLASTA online. В результате этой работы была показана гомология диагностических олигонуклеотидов для выявления неонкогенных штаммов серотипа 2 только с геном DNA-pol , и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями каких-либо других вирусов, бактерий или эукариот и с последовательностью данного гена у вирусов болезни Марека 1 и 3 серотипов.
 
Для выявления ВБМ 3 серотипа предложены праймеры и зонд, комплиментарные гену SORF1 HVT (серотип 3). Т. о., предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.
 
Подбор условий заключался в выборе температуры отжига праймеров и зондов, выборе оптимальной концентрации праймеров и зондов, оптимизации режима амплификации (в том числе выборе времени денатурации, отжига, элонгации, количества циклов ПЦР).
 
При проведении эксперимента была выявлена оптимальная концентрации праймеров, составившая 5 pmol /mkl. Зонды были взяты в концентрации 3 pmol /mkl, что было вполне достаточно в данном случае.
 
В ходе эксперимента было установлено, что оптимальной температурой для системы является температура в 60оС.
 
В результате проведенной работы были выбраны оптимальные условия Real-time PCR. Флуоресцентные зонды были подобраны таким образом, чтобы проводить идентификацию серотипов на разных каналах в приборе RotorGene 6000.
 
Разработанная система праймеров и зондов была использована для проверки вакцин, представленных на выборочный контроль.
 
В результате были сделаны выводы о возможности использования разработанной системы праймеров и зондов для подтверждения наличия в вакцинах вирусов болезни Марека 2 и 3 серотипов при проведении проверки вакцинных препаратов. Разработанные системы праймеров и зондов для выявления 2 и 3 серотипов ВБМ в комплексе с диагностической тест-системой для выявления ДНК возбудителя болезни Марека 1 серотипа, разработанной в 2011 году, позволяют идентифицировать все серотипы ВБМ методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
 

Пресс-служба ФГБУ «ВГНКИ»