Информация, доклады, сообщения

О разработке тест-системы «ВГЕ» для выявления РНК вируса гепатита Е

09.12.2012

Отделом биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий - Обухов И. Л., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы представлен отчет по теме «Разработка тест-системы «ВГЕ» для выявления РНК вируса гепатита Е». В отчете сообщается, что тест-система предназначена для выявления РНК вируса гепатита Е (Hepatitis E virus) в биологическом материале и объектах окружающей среды, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». 

Вирус гепатита Е (ВГЕ, HEV) - РНК-содержащий вирус, являющийся единственным представителем рода Hepevirus. Источником возбудителя является человек и некоторые животные, прежде всего свиньи и кабаны, для которых этот вирус практически не является патогенным. В настоящее время выявляют четыре генотипа ВГЕ (1-4), которые вызывают острый гепатит у людей, и два генотипа – 3-ий и 4-ый, которые циркулируют среди свиней. Результаты генотипирования изолятов ВГЕ, выделенных от человека и свиней, свидетельствуют, что роль животных, инфицированных ВГЕ как потенциальных источников инфекции для человека, значима на неэндемичных по гепатиту Е территориях.
 
На первом этапе разработки тест-системы был проведен поиск полногеномных нуклеотидных последовательностей ВГЕ в базе данных GeneBank.
 
На втором этапе было проведено выравнивание отобранных нуклеотидных последовательностей c целью поиска консервативных участков генома необходимых для выбора олигонуклеотидов (праймеров для амплификации и зондов для детекци). В качестве диагностической мишени был выбран фрагмент генома вируса в месте перекрывания ORF2 и ORF3.
 
На следующем этапе в поисковой системе Blast была проведена предварительная проверка специфичности праймеров и зондов. В результате этой работы было установлено, что выбранные олигонуклеотиды гомологичны только нуклеотидным последовательностям ВГЕ и не обнаружено их значимой гомологии с геномами других организмов, что позволяет выдвинуть предположение о 100% специфичности предложенных праймеров и зондов.
 
В тест-систему также были введены праймеры и зонд для внутреннего неконкурентного контрольного образца (ВКО), который позволяет контролировать все этапы проведения исследования.
 
Далее были разработаны и приготовленыстандартный образец предприятия «Положительный контрольный образец содержания РНК вируса гепатита E (рекомбинантный)(СОП ПКО HEV-rec), положительные контрольные образцы этапа выделения РНК (ПКО HEV-FL-rec) и амплификации ДНК (ПКО кДНК HEV-FL), которые содержали участок генома ВГЕ, использующийся в качестве диагностической мишени, и были определены концентрации этих образцов. Проведены эксперименты по определению рабочих концентраций праймеров и зондов, оптимизации условий проведения ОТ-ПЦР. Определены аналитические характеристики разработанного теста и рабочие концентрации СОП ПКО HEV-rec, ПКО HEV-FL-rec и ПКО кДНК HEV-FL.
 
Аналитическая чувствительность исследования была определена с помощью разведений СОП с известной концентрацией и составила 2,5*103 копий в мл тестируемого материала.
 
Для проверки аналитической специфичности были использованы ДНК/кДНК, имеющие высокую концентрацию, следующих организмов: вирус гепатита А (HAV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита D (HDV), вирус гепатита G (HGV), вирус иммунодефицита человека (HIV), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус простого герпеса 1 и 2 типов (HSV1 и HSV2), вирус герпеса человека 6 типа (HHV6), энтеровирус, ротавирус человека, астровирус, норовирус, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pantoea agglomerans, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteriditis, Salmonella typhi, Shigella flexneri 2a, Shigella sonniei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Yersinia enterocolitica и Homo sapiens. Перекрестные реакции для указанных организмов зарегистрированы не были.
 
Определение специфичности было проведено на 13 образцах, содержащих вирус гепатита Е, который был представлен различными генотипами – 1 генотип (3 образца), 2 генотип (2 образца), 3 генотип (7 образцов) и 4 генотип (1 образец). Генотип ВГЕ был определен с помощью секвенирования. При проведении исследования во всех образцах была обнаружена РНК ВГЕ.
 
Также в исследование были включены 118 anti-HEV IgM-негативных образцов плазмы крови, полученных от пациентов, инфицированных вирусами гепатитов А, В, С и D, и доноров. При проведении исследования в этих образцах РНК ВГЕ не была обнаружена.

Пресс-служба ФГБУ «ВГНКИ»