Информация, доклады, сообщения

О подвидовой дифференциации кабанов Sus scrofa молекулярно-генетическими методами

30.03.2012
Отдел Биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий - Обухов И. Л., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы представил отчет о разработке молекулярно-генетического метода подвидовой дифференциации кабанов. В связи с указанием Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (письмо № ФС-НВ-2/3926 от 5.04.2011) для реализации программ сохранения видового разнообразия животных необходимо отслеживание состояния популяций определенных видов, анализ динамики численности, особенностей размещения и размножения.
Популяционные исследования имеют большое значение не только в связи с необходимостью сохранении генофонда диких, малочисленных и исчезающих пород, но и для решения селекционно-генетических проблем в племенном животноводстве. Более того, известно, что дикие животные разных подвидов имеют различную восприимчивость к определенным болезням. В связи с этим представляет интерес изучение устойчивости подвидов кабанов Sus scrofa, обитающих на территории России, к болезням, наносящим серьезный урон свиноводству, в частности к вирусу африканской чумы свиней. Молекулярно-генетические методы подвидовой дифференциации позволяют достоверно охарактеризовать подвиды по особенностям их генетической структуры, определять состав популяции и следить за его изменением.
В отчете изложены следующие этапы работы. Это изучение особенностей генома диких кабанов Sus scrofa. Подбор и синтез праймеров для амплификации фрагментов митохондриального генома. Оптимизация условий ПЦР. Оптимизация условий выделения ДНК из тканей и крови животного. А также - оптимизация условий секвенирования ПЦР фрагментов. Помимо этого в отчете сообщается о проведенном молекулярно-генетическое исследовании тканей кабанов с целью установления их подвида. Выполнялись секвенирования ПЦР фрагментов, филогенетический анализ, сравнение исследуемых образцов между собой и с аналогичными последовательностями из Банка Генов базы данных Entrez с целью установления подвида.
Были выбраны праймеры для амплификации D-петли, гипервариабельного участка митохондриального генома Sus scrofa – с 15364 до 134 нуклеотидного положения на кольцевой митохондриальной ДНК Sus scrofa breed European wild boar haplotype WB6 (номер GenBank FJ237003). Размер амплифицируемой ДНК около 1700 п.н. (размер зависит от подвидовой принадлежности животного).
Выделение ДНК проводили методом сорбции на силикагеле с использованием набора "ДНК-сорб" (ЦНИИЭ). ПЦР проводили на амплификаторе ТЕРЦИК ("ДНК-технология") по методике ЦНИИЭ (состав реакционной смеси: 66мМ Tris-HCl pH 8,3, 16,7 мM (NH4)2SO4, 0,05 мг/мл БСА, 0,01% Tween-20, 8% глицерин, 3,0 мM MgCl2, 0,2 мM dNTPs, по 10 мкМ праймеров, 2,5 ед./100мкл Taq-полимеразы). Условия амплификации подбирали экспериментально. Продукты ПЦР визуализировали методом электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий.
Была проведена оптимизация условий выделения ДНК из тканей и постановки ПЦР. Были выбраны следующие условия ПЦР: 94°С - 15 сек, 60°С - 15 сек, 72°С - 100 сек, количество циклов - 35, предварительная денатурация 94°С - 3 мин и заключительная элонгация 72°С - 5 мин.
В результате амплификации ДНК для большинства исследуемых образцов были получены специфические ПЦР продукты. Секвенирование ПЦР-фрагментов осуществляли методом «cycle sequence» на амплификаторе Gene Amp PCR System 2720 (Applied Biosystems, США) с использованием набора BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit.
Полученные последовательности выравнивали с использованием программы AlignX из пакета программ Vector NTI Suite 6.0 и анализировали с использованием программы MEGA5 (Sudhir Kumar, Koichiro Tamura, Ingrid B. Jakobsen, and Masatoshi Nei: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software, Bioinformatics).
Из 70 предоставленных на исследование образцов мяса, для 67 проб последовательности ДНК L- и H- частей D-петли были определены секвенированием с обоих праймеров. Один образец содержал явную смесь образцов ДНК от разных животных, из двух образцов не удалось выделить пригодную для анализа ДНК.
На основании результатов секвенирования митохондриальной ДНК кабанов был проведен сравнительный анализ исследуемой области и определен уровень нуклеотидных отличий между разными животными и построены филогенетические деревья – по L и H частям D-петли.
Установлено, что уровень различий между нуклеотидными последовательностями колеблется от 0% до 2,9% для L-части D-петли. Уровень различий между нуклеотидными последовательностями H-части D-петли - от 0% до 1,7% .
На основании филогенетического анализа выявлены три группы животных. Группа 1 характеризуется большой вариабельностью, в пределах этой группы различается 9 гаплотипов по L-части и 5 гаплотипов по H-части D-петли. Все животные группы 2 принадлежат одному гаплотипу, была обнаружена 100% гомология нуклеотидных последовательностей исследуемой области. Группа 3 содержит 4 гаплотипа по L-части и 2 гаплотипа по H-части D-петли.