Информация, доклады, сообщения

О разработке иммунологических биочипов для выявления и дифференциации антител к патогенным серотипам лептоспир

28.03.2012
Отделом Биотехнологии (заведующий - Обухов И. Л., д.б.н., профессор) и Отделом качества и стандартизации иммунобиологических лекарственных средств для животных (заведующий – Скляров О.Д., д.в.н.)  в рамках проводимой научно-исследовательской работы представлен отчет о разработке иммунологических биочипов для выявления и дифференциации антител к патогенным серотипам лептоспир. Создание и внедрение в ветеринарную практику иммунологических биочипов для выявления и дифференциации антител к патогенным серотипам лептоспир является перспективным направлением развития диагностики лептоспироза. Эффективность иммунологических биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения большого количества специфических реакций взаимодействия иммобилизованных на биочипе антигенов с белками из сыворотки животных, что позволит быстро и эффективно выявлять и дифференцировать антитела ко всем серогруппам лептоспир в одном анализе.
В отчете сообщается о следующих этапах работы. Это подбор стандартизированной панели патогенных лептоспир известных серотипов. Культивирование лептоспир. Подбор стандартизованной панели сывороток против лептоспир различных серотипов. Выбор способа инактивации бактерий с сохранением антигенных свойств. Выбор подложки для создания биочипов. Выбор способа иммобилизации лептоспир на биочипе с условием максимального сохранения антигенных свойств.  
На сегодняшний день в диагностике лептоспироза наиболее специфичным и надежным серологическим методом считается реакция микроагглютинации (РМА) с живыми культурами лептоспир основных серогрупп. Основными недостатками РМА являются значительные затраты времени и труда на ее постановку, необходимость применения большого количества антигенов лептоспир разных серогрупп, необходимость контроля чистоты и качества используемых живых лептоспирозных антигенов, потенциальная опасность заражения проводящих серологическое исследование специалистов, субъективность оценки результатов.
Новый метод на основе иммунологических биочипов позволит быстро и эффективно выявлять и дифференцировать антитела ко всем серогруппам лептоспир в одном анализе. Для проведения данного исследования не требуется дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала, а также в этом методе не будут применяться живые культуры лептоспир.
В работе использовали натрий-фосфатный буфер pH 7.2 ( NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1.76 mM), формальдегид 36.5% (Sigma). Штаммы из коллекции ФГБУ «ВГНКИ»: Pomona (серогруппа Pomona), Perepelicin (серогруппа Tarassovi), Moskva V (серогруппа Grippotyphosa), Kabura (серогруппа Hebdomadis), 493 Poland (серогруппа Sejroe ), szwajizak (серогруппа Mini), Hond Utrecht IV (серогруппа Canicola), M-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae), HS-26 (серогруппа Bataviae), Veldrat Bataviae 46 (серогруппа Javanica ), Jez-1 (серогруппа Australis), Akijami A (серогруппа Autumnalis), Mus-127 (серогруппа Ballum), Salinem (серогруппа Pyrogenes), Vleermuis 3868 (серогруппа Cynopteri). Лептоспиры выращивали в стандартных условиях в среднем до концентрации 108 клеток/мл. Концентрацию оценивали микроскопией в темном поле.
В качестве стандартизованной панели сывороток против лептоспир различных серотипов были использованы гипериммунные групповые агглютинирующие сыворотки производства ФГУП «Армавирская биофабрика” к лептоспирам 15 серогрупп: Гриппотифоза, Помона, Иктерогеморрагия, Каникола, Тарассови, Бативия, Гебдомадис, Сейро, Мини, Аутумналис, Пирогенес, Баллум, Аустралис, Яваника, Циноптери.
Нанесение образцов на поверхность чипов осуществляли прибором NanoPlotterNP2 (GeSim, Германия) для микропечати с бесконтактным нанесением. Иммобилизованные на твердой подложке антигены инкубировали с сывороткой животного в течении 30-60 мин, затем отмывали буфером, образовавшиеся комплексы антиген-антитело выявляются в реакции с антивидовыми антителами, меченными флуоресцирующим веществом.
Для детекции иммунологической реакции использовали антивидовые антитела IgG к кролику коньюгированные с флуорофором DyLight 649 (DyLight 649-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG) , производства Jackson ImmunoResearch Ltd., США.
Сканирование флюоресценции чипа проводили с использованием автоматического флуоресцентного сканера ScanArray GX (Perkin Elmer, США).
Для инактивации лептоспир и подготовки антигенов использовали следующие методы, приводящие, по литературным данным, к потере лептоспирами вирулентности:
1.                      Термическая обработка – 2 часа 56 оС
2.                      Инактивация УФ 2 часа и 30 мин.
3.                      Обработка 0.25% формалином при 37 оС 1 час, 3 часа и 17 часов.
 
Подвижность и концентрацию полученных препаратов антигенов оценивали микроскопией в темном поле. После прогревания и длительного облучения УФ клетки лептоспир не наблюдались под микроскопом, что связано с их разложением, при обработке формалином (1 час, 3 часа и 17 часов) и при кратковременном облучении УФ (30 мин) лептоспиры теряли подвижность.
При разработке биочипа тестировали различные носители, с целью выбора оптимального, обеспечивающего максимальное сохранение антигенных свойств. Антигены лептоспир были напечатаны на:
  • — слайдах на нитроцеллюлозной основе PATHTM Protein Microarray Slide, Gentel Biosciences, Inc;
  • —  слайдах с альдегидными группамиVALS Vantage Aldehyde Arrayit corporation, США;
  • — слайдах с аминогруппами SuperAmine 2, Arrayit corporation, США;
  • — Слайдах с эпокси группами VEPO CEL Vantage Epoxy, Cel Associates, США.
 
Специфичность и  чувствительность иммунологической реакции для иммобилизованных антигенов не зависела от типа поверхности тестированных слайдов. Поэтому в дальнейшей работе использовали более дешевые альдегидные VALS слайды.
Антигены лептоспир, прогретые 2 часа при 56 оС в натрий-фосфатном буфере, показывали неспецифическое связывание с сыворотками против лептоспир всех серотипов. Аналогичный результат с неспецифичным связыванием был получен и для антигенов подвергнутых длительному облучению УФ (2 часа). По-видимому, потеря антигенами лептоспир специфичности в данных случаях связана с их разрушением и нарушением сложной антигенной организации, ассоциированной с липидными и полисахаридыми комплексами белков.
Для сохранения специфичности поверхностных липидных и полисахаридных антигенных комплексов белков использовали обработку формалином, так как в данном случае клетки лептоспир остаются интактными. Инактивация лептоспир 0.25 % формалином часто применяется в технологии изготовления инактивированных вакцин. Для получения антигенов лептоспиры инкубировали при 37 оС в 0.25% формалине в натрий-фосфатном буфере в течении 1, 3 и 17 часов. Обработанные формалином препараты были протестированы с помощью стандартной РМА. Было выяснено, что антигены не теряли или теряли не более 50% своей антигенной активности по сравнению с живыми лептоспирами, при этом серогрупповая специфичность сохранялась. Так как обработанные 0.25 % формалином в течении 1 часа лептоспиры обладали большей антигенной активностью по сравнению с обработанными в течении 17 часов, в дальнейшей работе использовали препараты, обработанные формалином в течении 1 часа. Приготовленные таким образом антигены могли храниться не менее трех месяцев при +4оС без изменения антигенных свойств.
Но к сожалению, после нанесения на поверхность слайдов, лептоспиры некоторых серогрупп (Яваника, Сейро) значительно теряли антигенные свойства. Поэтому в дальнейшем  планируется оптимизировать условия иммобилизации лептоспир различных серогрупп на слайдах с условием максимального сохранения антигенных свойств.
Был выбран способ инактивации лептоспир обработкой 0.25% формалином при 37С в течении 1 часа, позволяющий сохранить групповую специфичность антигенов. На основании тестирования различных носителей для иммобилизации антигенов были выбраны cлайды с альдегидными группами VALS.
В дальнейшем планируется оптимизировать условия иммобилизации различных серогрупп лептоспир на слайдах с условием максимального сохранения антигенных свойств и групповой специфичности, провести тестирование клинического материала - сывороток крови животных, положительных и отрицательных в РМА   с антигенами лептоспир.