Информация, доклады, сообщения

О разработке методики скринингового определения остаточного содержания препаратов группы хинолонов в продукции животного происхождения методом иммуноферментного анализа (ИФА)

02.04.2012
Отдел безопасности кормов и пищевых продуктов ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий – Комаров А.А., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы представил отчет о разработке методики скринингового определения остаточного содержания препаратов группы хинолонов в продукции животного происхождения методом ИФА. Эти разработки являются составной частью исследований по теме «Методы определения остаточных количеств лекарственных средств в продукции животного происхождения».
Хинолоны – антибиотики широкого спектра действия. Класс хинолонов включает две основные группы препаратов, различающихся по структуре и активности: нефторированные хинолоны и фторхинолоны. Несмотря на сходство химического строения нефторированных и фторированных хинолонов, они существенно отличаются по своим свойствам, что дает основание рассматривать фторхинолоны в качестве самостоятельной группы препаратов в рамках класса хинолонов.
В большинстве стран мира, в том числе и в России, приняты нормативные акты, гарантирующие безопасность продуктов питания для здоровья потребителя, в которых установлены допустимые уровни содержания химических загрязнителей, представляющих опасность для здоровья человека. Например, Директива ЕEC 2377/90 [4] определяет процедуру установления максимально допустимых уровней (МДУ) остаточных количеств ветеринарных препаратов в пищевых продуктах животного происхождения. Остаточные количества ветеринарных лекарственных препаратов — это все фармакологически активные вещества, в том числе действующие вещества, наполнители, продукты распада, и их метаболиты, которые остаются в пищевых продуктах, полученных из животных, к которым применялись данные ветеринарные препараты. МДУ лекарственного средства в продукции животноводства — это его максимальная концентрация, которая не оказывает отрицательного воздействия на здоровье потребителей, устанавливается на основе оценки рисков и может быть принята как законодательно разрешенная. МДУ для фармакологически активных веществ, которые разрешены к применению (например, ФХ, антибиотики тетрациклиновой группы и др.), приведены в приложениях I и III Директивы ЕEC 2377/90.
В ЕС были проведены исследования, которые послужили основой для введения в действие новой редакции европейской директивы EEC 2377/90, устанавливающей МДУ остатков некоторых ФХ, включая энрофлоксацин и ципрофлоксацин, в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Согласно европейской директиве ЕЕС 2377/90, МДУ остаточного количества ФХ в продукции животноводства составляет от 10 до 1900 мкг кг-1. Например, для содержания энрофлоксацина в мясе и почках разных видов животных МДУ установлен на уровне 100-300 мкг кг-1, а в молоке – 100,мкг кг-1. В России постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 12.11.2010 N 145 "Об утверждении СанПиН 2.3.2.2757-10 - дополнение N 21 к СанПиН 2.3.2.1078-01 (зарегистрировано в Минюсте России 21.12.2010, регистрационный номер 19298) [1] также утверждены допустимые уровни содержания антибиотиков хинолоновой группы в продукции животноводства, что подтверждает актуальность разработки и введения в практику ветеринарного надзора чувствительных, специфичных и экономичных методов контроля содержания ФХ в продуктах питания.
Наиболее часто используемыми методами определения остаточного содержания антибиотиков в продукции животноводства являются микробиологический, хроматографический, хромато-масс-спектрометрический анализы. Однако эти методы зачастую дороги, трудоемки и не всегда достаточно чувствительны, поэтому существует необходимость разработки более доступных и чувствительных методов для целей мониторинга.
В последнее десятилетие иммуноферментный анализ (ИФА) часто применяют для определения содержания остатков загрязняющих веществ в продукции животноводства. Этот метод достаточно чувствителен, специфичен и прост в исполнении. За рубежом разработаны и нашли практическое применение диагностические тест-системы ИФА для определения остаточных количеств ФХ в продукции животноводства. Подобные отечественные тест-системы ИФА в настоящее время не внедрены в ветеринарную практику.
Целью данной работы явилась разработка чувствительной тест-системы на основе непрямого твердофазного конкурентного ИФА (НТК ИФА) для определения остаточных количеств ФХ в продукции животноводства.
В ветеринарной практике для лечения животных наиболее часто применяют ФХ – энрофлоксацин и ципрофлоксацин, которые впоследствии могут присутствовать в остаточных количествах в продукции животноводства.
Для определения остаточных количеств ФХ в различных субстратах (мясе, молоке, яйцах, рыбе, меде) используют хроматографические и хромато-масс-спектрометрические методы. Среди иммунохимических методов можно отметить конкурентный ИФА, который в последние годы часто используется для этих целей.
Чувствительность и специфичность НТК ИФА зависят от ряда факторов: особенностей строения ТВ-АГ (конъюгатов ФХ с белками-носителями), а также специфичности и чувствительности сыворотки. Отмечено, что чувствительность метода может повышаться в результате варьирования пар ТВ-АГ/АТ в гомологичном и гетерологичном форматах ИФА, а также зависит от подбора их оптимального соотношения и условий проведения реакции.
Целью данного исследования явилась разработка НТК ИФА для определения остаточных количеств ФХ в продукции животноводства. В результате получены следующие выводы.
Карбодиимидным методом синтезированы конъюгаты ФХ (ЭНР, ЦИП, НОР, ОФЛО и ∑ФХ) с белками-носителями БСА, ГЛУ и СИТ, активированными ЭДК и ДЦК.
Проведена иммунизация кроликов шестью конъюгатами по 11 схемам.
Получено 150 поликлональных сывороток, среди которых выбраны две – 3/1 и 33/9, обладающие высокой активностью, чувствительностью и специфичностью в НТК ИФА при определении ФХ.
Подобраны условия проведения НТК ИФА и разработаны 2 тест-системы, с помощью которых предлагается определять остаточное содержание ФХ в продукции животноводства:
·     «ФТОРХИНОЛОНЫ – ИФА» – группоспецифическая тест-система для определения группы ФХ (ЭНР, ЦИП, ДАН и НОР) с использованием сыворотки №33/9 в рабочем разведении 1/800, полученной на введение кроликам конъюгата, синтезированного из суммы ФХ (ЭНР, ЦИП, ОФЛО И НОР) с БСА, на твердофазном антигене НОР–БСА. Диапазоны определения ФХ составили: ЭНР – 0,5–128, ЦИП – 1,0–200,0, ДАН – 0,5–128 и НОР – 30–500 мкг л-1.
·     «ЭНРОФЛОКСАЦИН – ИФА» – моноспецифическая тест-система, предназначенная для определения энрофлоксацина с использованием сыворотки №3/1 в рабочем разведении 1/800, полученной на введение конъюгата ЭНР-БСА (∑ДЦК+ЭДК), на твердофазном антигене ЭНР-БСА (ЭДК). Диапазон определения энрофлоксацина составил 0,01–40 мкг л-1.
 
Подобраны методы экстракции образцов мяса, рыбы, яиц и молока, обеспечивающие 75-150% степень извлечения ФХ.
 
Пределы количественного определения энрофлоксацина в различных матрицах с использованием подобранных методов экстракции с помощью двух разработанных тест-систем составил:
- для тест-системы «ЭНРОФЛОКСАЦИН – ИФА» – 0,1 мкг кг-1
- для тест-системы «ФТОРХИНОЛОНЫ – ИФА» – 10 мкг кг-1