Информация, доклады, сообщения

О разработке ПЦР тест-системы для выявления вируса болезни Марека 1 серотипа

05.04.2012
Отдел Биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий - Обухов И. Л., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы представил отчет о разработке ПЦР тест-системы для выявления вируса болезни Марека 1 серотипа. В связи с тем, что стандартные методы диагностики трудоемки, продолжительны по времени и требуют значительных экономических затрат, большое распространение получает диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), как более чувствительная и оперативная.
Возбудителем болезни Марека является Herpesvirus galli-2, представитель семейства Herpesviridae. В настоящий момент данное семейство представлено 200 открытыми видами герпесвирусов. По современной классификации группу вируса болезни Марека (ВБМ) подразделяют на 3 серотипа. Серотип 1 включает все онкогенные вирусы и аттенуированные варианты. Штаммы этого серотипа вируса различаются по патогенности: от вирулентных до высоковирулентных. Вирусы второго и третьего серотипов для кур не патогенны и используются для изготовления вакцин. Диагностика болезни основана на оценке патологоанатомических признаков, подтвержденных гистологическими методами. Окончательный диагноз устанавливается лабораторными методами, согласно ГОСТ 25586-83, предусматривающему, в частности, обнаружение антигенов вируса в РДП, выделение вируса и идентификацию в чувствительных биологических системах (куриные эмбрионы и культуры клеток).
На первом этапе была проанализирована литература, характеризующая структуру генома и различия на нуклеотидном уровне серотипов вируса болезни Марека. Далее был проведен поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса, опубликованных в базе данных GeneBank.
На втором этапе было проведено выравнивание отобранных нуклеотидных последовательностей c целью их последующего анализа на вариабельность и поиска консервативных участков необходимых для выбора праймеров. В качестве идентифицирующего гена был выбран ген Меq, кодирующий белок, отсутствующий во 2 и 3 серотипе ВБМ. Предполагается, что он отвечает за онкогенные свойства вируса. Выбранная пара праймеров Meq-F и Meq-R позволяет амплифицировать фрагмент размеров 67 п.н. В качестве эндогенного контрольного гена был выбран ген курицы Сol VI A2 , кодирующий α2 субьединицу коллагена 6 типа. Праймеры Chick-F и Chick-R, комплиментарные фрагменту данного гена позволяют амплифицировать фрагмент размером 75 п.н.
На следующем этапе была изучена специфичность предложенных праймеров с помощью компьютерной программы BLASTA online. В результате этой работы была показана гомология диагностических олигонуклеотидов только с геном meq ВБМ, и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями каких-либо других вирусов, бактерий или эукариот. Т. о., предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью. Для праймеров и зонда эндогенного контроля также показана 100% специфичность.
Подбор условий заключался в выборе температуры отжига праймеров и зондов, выборе оптимальной концентрации праймеров и зондов, оптимизации режима амплификации (в том числе выборе времени денатурации, отжига, элонгации, количества циклов ПЦР).
При проведении эксперимента была выявлена оптимальная концентрации праймеров, подобранных на ген Meq, составившая 5 pmol /mkl. Такая концентрация сделала тест-систему максимально чувствительной и одновременно с этим не давала ложно-положительных результатов.
Зонды были взяты в концентрации 3 pmol /mkl, что было вполне достаточно для нашей системы.
При тестировании образцов концентрацию праймеров, подобранных на ген Сol VI A2 варьировали от 5 pmol /mkl до 10 pmol/mkl. Было показано, что увеличение концентрации праймера до 10 pmol /mkl не дает возможности увеличить чувствительность системы.
Температуру отжига праймеров варьировали от 60 до 63оС. В ходе эксперимента было установлено, что оптимальной температурой для нашей системы является температура в 60оС.
Количество циклов амплификации варьировали от 35 до 40. Увеличение количества циклов лишь увеличило время проведения теста, но не дало увеличить чувствительность. Также большее количество циклов увеличило риск появления ложно-положительных результатов.
Проведена оптимизация уровня детектирования сигнала красителей FAM и R6G прибором Rotor Gene 6000. Для красителя FAM показатели максимального значения сигнала варьировали от 10 до 15 единиц, минимального от 5 до 10 единиц. Установлено, что оптимальными являются для FAM значения 10-15 единиц, для R6G 5-10 единиц.
В результате проведенной работы были выбраны оптимальные условия Real-time PCR.
Были определены аналитические характеристики разрабатываемой тест-системы при тестировании образцов из материала, присланного птицефабриками в лабораторию ФГБУ «ВГНКИ», а также вакцинных препаратов, содержащих различные серотипы ВБМ.
Специфичность разработанной ПЦР тест-системы определяли путем реакции амплификации с использованием панели гетерологичных возбудителей болезней птиц.
Для определения чувствительности ПЦР в лабораторных условиях использовали вакцинный штамм «CVI-988», с инфекционным титром 106 БОЕ/мл, который подвергся титрованию путем последовательных десятикратных разведений  до конечного разведения 10-2 и амплифицировали. Титровка первоначально проводилась в физиологическом растворе. Чувствительность разработанной нами тест-системы составила 4*10-2БОЕ/в пробе (Рис.7). Далее мы проводили титровку в суспензии органов. Наличие в пробе большого количества ДНК птицы не снизило чувствительность тест-системы.
В ходе проведения диагностических исследований патологического материала от погибшей или вынужденно убитой домашней птицы методом ПЦР тест-система была апробирована на 46 образцах. В 5 образцах была обнаружена ДНК вируса болезни Марека 1 серотипа.
Разработанная тест-система была использована для проверки вакцин, представленных на выборочный контроль на наличие вируса болезни Марека 1 серотипа.
Для исследования были предоставлены:
Вакцина Бимарек (ВНИИЗЖ) серия 20126011
Вакцина Бимарек (ВНИИЗЖ) серия 30126011
Марек-R (ВНИИЗЖ) серия 04030910
В результате проведенной работы были сделаны следующие выводы:
- В образцах вакцины Бимарек 1 серотип ВБМ обнаружен не был.
- Вакцина Марек-R (ВНИИЗЖ) серия 04030910 содержит вирус болезни Марека 1 серотипа.
В 2008 году институтом экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук была зарегистрирована тест-система для обнаружения ДНК вируса болезни Марека. По окончании разработки и тестирования нашей системы мы провели сопоставление аналитических характеристик по следующим параметрам: детекция продуктов амплификации, специфичность, чувствительность, наличие внутреннего контрольного образца.
В первую очередь нами было отмечено разное назначение тест-систем, связанное с тем, что система ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии выявляет, но не дифференцирует все три серотипа ВБМ, а нами разработанная система идентифицирует только первый, патогенный серотип вируса. Использование тест-системы ГНУ ИЭВСиДВ оправдано в случае проведения контроля эффективности вакцинации при использовании живых вакцин против ВБМ, содержащих разные серотипы вируса. Разработанная нами тест-система предназначена для выявления именно патогенного 1-го серотипа ВБМ и особенно оправдана при использовании для анализа материала от птиц при подозрении на заболевание. Кроме того, с помощью разработанной нами тест-системы можно проводить контроль биологических препаратов, в том числе вакцин против БМ на основе 2 и 3 серотипов, на контаминацию вирусом 1 серотипа.
Тест-системы оказались различны как по типу детекции результатов амплификации, так и по чувствительности.
Из всего выше указанного очевидны преимущества системы, разработанной на базе ФГБУ «ВГНКИ» перед ранее зарегистрированной в ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии системой.

Таким образом, разработанная тест-система предназначена для выявления ДНК вируса болезни Марека 1 серотипа методом ПЦР в культуральной жидкости при культивировании вируса болезни Марека, в биологических препаратах при подозрении на контаминацию вирусом болезни Марека, в биологическом материале от птицы, восприимчивой к болезни Марека и не вакцинированной против данного заболевания с использованием живой вакцины содержащей ВБМ 1 серотипа.