Информация, доклады, сообщения

О разработке тест-системы для выявления РНК и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС)

09.04.2012
Отдел Биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий - Обухов И. Л., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы представил отчет о разработке тест-системы для выявления РНК и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС). Тест-система предназначена для выявления РНК и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной  детекцией в режиме «реального времени».
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС, «синее ухо», поздний эпизоотический аборт свиней) – контагиозное заболевание, характеризующееся поздними абортами, преждевременными опоросами, прохолостами у свиноматок, рождением мертвых, нежизнеспособных, мумифицированных и уродливых поросят, гибелью новорожденных поросят, поражением органов дыхания у поросят разных возрастных групп. Возбудитель болезни – вирус семейства Arteriviridae, рода Arterivirus. Различают два генотипа вируса: европейский и американский. Все вспышки РРСС на территории России в период с 1996 по 2006 год были вызваны вирусом европейского генотипа, но с 2007г. появляется информация о возникновении заболеваний, вызванных вирусом РРСС американского генотипа. Геном вируса РРСС очень вариабелен, даже внутри одного генотипа наблюдаются значительные отличия.
На первом этапе была проанализирована литература, характеризующая структуру генома и различия на нуклеотидном уровне европейского и американского генотипов вируса РРСС. Далее был проведен поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса РРСС, опубликованных в базе данных GeneBank.
На втором этапе было проведено выравнивание отобранных нуклеотидных последовательностей c целью их последующего анализа на вариабельность и поиска консервативных участков необходимых для выбора праймеров. В качестве мишени для специфических праймеров и зондов был выбран ген ORF 7, который является наиболее консервативным внутри каждого генотипа, но позволяет дифференцировать европейский и американский генотипы вируса РРСС.
На следующем этапе была изучена специфичность предложенных праймеров с помощью компьютерной программы BLASTA online. В результате этой работы была показана гомология выбранных олигонуклеотидов только с геном ORF 7 вируса РРСС и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями каких-либо других вирусов, бактерий или эукариот. Т. о., предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.
В тест-систему также были введены праймеры и зонд для внутреннего неконкурентного контроля. Введение этих праймеров позволяет проводить контроль качества выделения ДНК и возникновения ложноотрицательных результатов.
Далее был проведен ряд экспериментов по определению рабочих концентраций праймеров и зондов, обеспечивающих необходимую чувствительность анализа, оптимизированы условия проведения ПЦР и определены специфичность и чувствительность тест-системы.
Определение аналитической чувствительности проводилось на панелях образцов сыворотки крови, патматериала (смесь разных внутренних органов) и спермы, содержащих штаммы европейского и американского генотипов в известной концентрации. Концентрация вируса определялась с помощью калибраторов, представляющих собой препараты, полученные путем вставки участка гена ORF 7 вируса обоих генотипов в плазмиду pGEM-t (ПКО PRRS RUS и ПКО PRRS NA). Чувствительность при исследовании сыворотки крови и патматериала составила 1х103 коп/мл, спермы – 5х103 коп/мл для каждого генотипа.
Подобраны концентрации препаратов ПКО PRRS RUS, ПКО PRRS NA и ПКО STI-88, предлагаемые в качестве положительного контроля для ПЦР.
Специфичность праймеров тестировали с использованием штаммов цирковируса свиней 2-го типа (PCV), парвовируса свиней (PPV), вируса классической чумы свиней (КЧС), вируса африканской чумы свиней (ASFV), вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (TGEV), вируса эпидемической диареи свиней (PEDV), ротавируса А (RotaA), вируса болезни Ауэски (ADV), Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Brucella suis, Chlamydia suis, Chlamydophila pecorum, Haemophilis parasuis, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Pasterella multocida, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Salmonella Сholerasuis, Salmonella Dublin, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Streptococcus suis, Clostridium perfringens, Klebsiella pneumoniae.
Также специфичность праймеров исследована на 50 пробах крови, патматериала и спермы от свиней, полученныхот клинически здоровых животных. Ложно-положительных результатов не было получено ни в одном случае.
Проверку работы тест-системы проводили на биологическом материале, полученном из Белгородской области во время вспышки РРСС в июле 2010 года. В 21 пробе, что составило 84% исследованных образцов, обнаружен вирус РРСС европейского генотипа. Положительные результаты подтверждены секвенированием.

В период с октября 2008 по сентябрь 2011г нами протестированы на наличие вируса РРСС 670 образцов различного биоматериала, полученных из нескольких хозяйств республики Чувашии, Калужской, Белгородской и Ростовской областей для анализа на различные патогены. Вирус РРСС обнаружен в 47 образцах, что составило 7% исследованных образцов. Во всех случаях выявлен европейский генотип вируса.