Информация, доклады, сообщения

О разработке хроматографических и масс-спектрометрических условий многокомпонентного определения остаточных количеств лекарственных средств

10.05.2012
Отдел безопасности кормов и пищевых продуктов ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий – Комаров А.А., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы по теме «Методика многокомпонентного определения остаточных количеств лекарственных препаратов в продукции животноводства методом СВЭЖХ/ВПМС ВР» представил отчет о завершении 1-го этапа исследований, заключающихся в разработке хроматографических и масс-спектрометрических условий многокомпонентного определения остаточных количеств лекарственных средств.
 
В настоящее время существует огромное количество лекарственных препаратов, бесконтрольное применение которых чревато негативными последствиями. Часть таких препаратов: хинолоны, сульфаниламиды, нитроимидазолы, пенициллины и тетрациклины, обладают широким спектром антимикробного действия и используются для лечения, профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, микоплазмоза, болезней органов дыхания, болезней мочеполового аппарата и др. Однако, применение этих препаратов несет риск возникновения побочных эффектов: от дерматитов до появления антибиотико-резистентных штаммов кампило-бактерий и сальмонелл у человека. Кроме того, имеются сведения о гемотоксичности и канцерогенных свойствах некоторых сульфаниламидных препаратов.
 
Противопаразитарные препараты: кокцидиостатики, антгельминтики также имеют широкий спектр побочных явлений. В связи с их чрезмерным применением и несоблюдением сроков ожидания для убойных животных, остаточных количества могут оказывать на человека нефротоксическое,   мутагенное и тератогенное действие, а также канцерогенное влияние.
 
Так, например, лошади и некоторые виды птиц особенно чувствительны к токсичности ионофоров. Последствие интоксикации - дегенерация мышц, невропатия, угнетение сердечной мышцы, зачастую с летальным исходом.
 
Все вышеперечисленные негативные воздействия заставляют нас тщательным образом следить за присутствием остаточных количеств лекарственных препаратов в продукции животноводства. Успешное решение этой задачи выполнимо с помощью скрининговых методов, обладающих достаточно высокой чувствительностью и селективностью. Нами предлагается использование сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии и квадрупольно-времяпролетной масс-спектрометрии высокого разрешения, которые позволяет проводить достоверное определение в одной пробе соединений различных групп при минимальной пробоподготовке образцов.
 
Измерения проводили методом время-пролетной масс-спектрометрии сверх высокого разрешения на спектрометре Maxis.
 
Проводили детектирование аналитов по отношению m/z в режиме получения положительно заряженных молекулярных ионов. Для ввода применяли источник ионизации электрораспылением, в качестве газа использовали азот. Ионную оптику настраивали в режиме «высокая чувствительность/разрешение».
 
Оптимизацию условий хроматографического разделения проводили по растворам с концентрациями 0,05 и 0,1 мг/л с помощью программного обеспечения спектрометра Target Analysis и Data Analysis.
 
Для проведения калибровки по массам, в квадрупольно- времяпролетном масс-спектрометре сверхвысокого разрешения MAXIS, использовался калибровочный раствор, содержащий кластеры формиата/ацетата натрия с различной брутто формулой. Всего насчитывается около 57 комбинаций. Для калибровки выбирались наиболее интенсивные, более 43 у.е., по шкале интенсивности.
 
Поскольку в качестве исследуемого материала предполагается использовать продукцию животноводства, следует обратить особое внимание на процедуру подготовки проб к анализу.
 
С появлением подобных аналитических систем многие специалисты возлагали надежды на пробоподготовку по ускоренному принципу, которая состояла бы из нескольких этапов: экстракции, обезжиривания (в случае необходимости) и концентрирование в токе азота. Однако наши эксперименты установили, что, несмотря на высокое (до 60000) разрешение, и как следствие отсутствие матричного эффекта, фона, вновь мы вынуждены прибегать к дополнительным процедурам очистки. Это обусловлено строением оборудования, которое не позволяет работать с пробами, не проходившими процедуры ТФЭ и др. Подобные проблемы выражаются в скором загрязнении колонки хроматографа, отсека электрораспыления масс-спектрометра уже после двух образцов. Кроме того, в результате этого происходит понижение чувствительности и загрязнение ионной оптики.
 
Был проведен ряд экспериментов, направленный на разработку первичной стратегии подготовки проб, благодаря которым мы склонны применять принцип поочередной экстракции растворителями, упаривание и процедуру ТФЭ.
 
В нашей работе исследовались возможности многокомпонентного определения остаточных количеств лекарственных препаратов и их метаболитов в продукции животноводства. Работа проводилась на базе имеющегося в ВГНКИ оборудования и включала следующие этапы: настройка сопряженной системы СВЭЖХ – ВПМС ВР, выбор оптимальных параметров хроматографической и масс-спектрометричекой систем для надежного идентифицирования аналитов.
 
На этапе оптимизации хроматографической части сопряженной системы мы столкнулись с рядом трудностей, вызванных существенными различиями в структуре, и как следствие сложностью подбора подвижных фаз. В качестве подвижных фаз, в подобных работах многие авторы используют воду в качестве фазы А и метанол/ацетонитрил в качестве фазы Б. Однако, данные фазы были неприменимы к нашим аналитам. В результате серий экспериментов были подобраны оптимальные для наших целей фазы, которые позволили получить хорошую форму пика и обеспечить достаточно большие временные интервалы между группами аналитов, благодаря которым удалось применить различные настройки масс-спектрометрической части системы.
 
На этапе оптимизации масс-спектрометрической части мы также были вынуждены искать компромисс между различными настройками. Изначально планировалось не изменять настойки по сегментарному принципу. Однако серии экспериментов показали, что, оставив общие значения, мы сильно проигрываем в чувствительности. Данного явления удалось избежать, применив для каждой группы аналитов свои настройки. Также было важно найти оптимальный калибрант для системы в целом, позволяющий получать минимальное отклонение от точной массы во всем диапазоне измерений. Таким калибрантом оказался раствор формиата/ацетата натрия. Благодаря наличию большого числа различных кластеров, он помог полностью решить проблемы с калибровкой. Точность измерения массы составила 0,2 ppm.
 
В результате процессов оптимизации СВЭЖХ-ВПМС ВР системы удалось разработать метод идентификации 86 лекарственных препаратов и их метаболитов.