Информация, доклады, сообщения

О разработке методики определения ферментативной активности β-глюканазы в ферментных препаратах для животных

23.05.2012

Отдел безопасности кормов и пищевых продуктов ФГБУ «ВГНКИ» (заведующий – Комаров А.А., д.б.н., профессор) в рамках проводимой научно-исследовательской работы по теме «Разработка и стандартизация методов анализа кормов, кормовых добавок, лекарственных средств  для животных и продукции животноводства» представил отчет о выполнении 1-го задания исследований, заключающихся в разработке методики определения ферментативной активности β-глюканазы в ферментных препаратах для животных. 

Необходимость стандартизации методов анализа ферментативных активностей в ферментных препаратах назрела в связи с появлением на отечественном рынке большого количества ферментных препаратов, предназначенных для использования в качестве кормовых добавок.  

В настоящее время существует ГОСТ на методы контроля ферментных препаратов – ГОСТ 20264. ГОСТ включает методы приемки и отбора проб (ГОСТ 20264.0-74), определения органолептических, физико-химических и микробиологических показателей (ГОСТ 20264.1-74), а также определения ряда ферментативных активностей: протеолитической (ГОСТ 20264.2-74), пектолитической  (ГОСТ 20264.3-81), амилолитической и глюкоамилазной (ГОСТ 20264.4-74).  

Имеются ГОСТы на «Препараты ферментные» типа Технических условий: «Препарат ферментный. Амилоризин П10х» (ГОСТ 18919-73); «Препараты ферментные. Пектаваморин П10х и Г10х» (ГОСТ 18920-73); «Препарат ферментный. Амилосубтилин Г3х» (ГОСТ 23635-90); «Препарат ферментный. Протосубтилин Г3х» (ГОСТ 23636-90).  

Вступили в действие разработанные нами ранее национальные ГОСТы на методы определения ферментативных активностей ксиланазы, целлюлазы и фитазы: ГОСТ Р 53047-2008, ГОСТ Р 53045-2008 и ГОСТ Р 53360-2009. Указанные ГОСТы позволяют определять активность ферментов, вводимых в состав многих кормовых добавок для сельскохозяйственных животных, в том числе птицы – в основном, для моногастричных животных (свиней, поросят), но также для молодняка крупного и мелкого рогатого скота с недостаточно сложившейся собственной ферментной системой. Кормовые добавки, содержащие b-глюканазу, ксиланазу и целлюлолитический комплекс, способствуют расщеплению антипитательных веществ растительных кормов, в частности остовых полисахаридов, которые составляют основу клеточной стенки растений: целлюлозы и гемицеллюлоз.  

На отечественный рынок ежегодно поступают ферментативные кормовые добавки производства разных стран (США, Великобритании, Бельгии, Болгарии, Финляндии, Дании, Голландии, Германии и др.) – более 40 наименований. В связи с этим, разработанные ФГБУ «ВГНКИ» национальные ГОСТы: ГОСТ Р 53047-2008, ГОСТ Р 53045-2008 и ГОСТ Р 53360-2009 – на ферментные препараты ксиланазы, целлюлазы и фитазы - были очень своевременны и обеспечили исследователей унифицированными методами анализа по указанным ферментативным активностям.  

Однако осталась потребность в аналогичном ГОСТе для определения β-глюканазной активности. Практически абсолютное большинство предлагаемых ферментных препаратов гликолитического действия, а также мульти- и комби-препаратов содержат β-глюканазную активность.  

Методы, предлагаемые различными фирмами, так же как это имело место и с препаратами ксиланазы и целлюлазы, различаются понятием единицы активности; выбором основных условий проведения ферментативной реакции; методом детекции продуктов реакции и оценкой полученных результатов, в том числе системой расчета.  

Цель настоящей работы: унифицировать методы определения β-глюканазной активности, и на их основе разработать национальный стандарт (ГОСТ) для определения активности фермента в кормовых добавках.

В процессе исследований предполагалось решить следующие задачи: 

1. Изучить существующие методы определения, в т.ч. предлагаемые фирмами – производителями β-глюканазных ферментных препаратов.

2. Выбрать 1-3 метода, наиболее часто применяемых в настоящее время  для анализа ферментных препаратов. 

3. Провести сравнительные испытания методов определения β-глюканазной активности и на основании полученных результатов определить оптимальные условия постановки реакции.

4. Разработать проекты предварительных редакций ГОСТа и представить их для дальнейшего согласования.

Определение ферментативной активности проводили методами, принятыми для анализа экзо-глюканазных препаратов: проведение ферментативной реакции в пробирках и колориметрическое детектирование редуцирующих сахаров, освобождающихся при ферментации субстрата β-глюкана.

При сравнительных испытаниях трех методов индикации продуктов ферментации субстрата β-глюкана с образованием окрашенных производных глюкозидых остатков были отобраны два метода. Метод определения глюкозы с феррицианидом калия, который широко использовался в лабораториях в 60-70-ые годы, имеет ряд существенных недостатков для определения ферментативной активности. Метод основан на обратно-пропорциональной зависимости степени окраски от концентрации действующего вещества, что связано с определенными неудобствами, и имеет невысокие специфичность и чувствительность.

Мы остановились на двух других методах. Метод с арсено-молибденовым реактивом – Шомоди-Нельсона – известен с  40-х годов прошлого века, но благодаря своей высокой чувствительности, пользуется популярностью и в настоящее время. Метод с ДНС – более простой в исполнении и позволяет определять не только свободные остатки глюкозы, но и редуцирующие сахара концевых групп олигосахаридов. В процессе исследований отработаны  условия для постановки обоих методов.

Сравнительные исследования активности β-глюканазы в ферментативных кормовых добавках с использованием указанных цветных реакций показали различия в их чувствительности и специфичности. В связи с более широким спектром действия метода с ДНС (моносахариды и концевые группы олигосахаридов) результаты, получаемые этим методом выше, с арсено-молибденовым реактивом. Однако при использовании коэффициента пересчета методы могут использоваться в качестве альтернативных. В результате параллельных постановок анализа образцов с обоими методами установлен коэффициент корреляции между ними.

На основании полученных данных составлена 1 редакция национального ГОСТа по определению ферментативной активности β-глюканазы в ферментных кормовых добавках и кормовых смесях, которая была представлена в сайте ФГБУ «ВГНКИ» для ознакомления и обсуждения (http://www.vgnki.ru/about/docs/).